التطبيقات الحديثة في أبحاث نحل العسل - حسام أبو شعرة

التطبيقات الحديثة في أبحاث نحل العسل

حسـام فرج إبراهيـم أبو شـعرةمدرس مساعد بكلية الزراعة- بدمنهور- جامعة الإسكندرية- مصر

عضو المنظمة الدولية لدراسة علوم الحشرات الاجتماعية – بأمريكا وألـمانيا

 

مـقــدمــة:

     ان الصراع الحالي في مجال البحث العلمي يقتضى إلمام الباحث العربي بأساسيات الهندسة الوراثية والتطبيقات الحديثة لها في مجال نحل العسل. لذلك فإني سوف أستعرض في هذه المقالة بصورة مبسطة وخطوة بخطوة طرق استخدام التقنيات الحديثة في نحل العسل داعياً الله أن يوفق الباحثين العرب للارتقاء بأبحاثهم لما يفيد الوطن العربي و يرفع درجة المنافسة على النشر في المجلات والمؤتمرات العالمية. 

الجزء الثاني: الـ PCR

الجزء الأول

( استخلاص الـ DNA)

 

مـا هو الـ DNA؟

     DNA هو المادة الوراثية الأساسية. وهو عبارة عن شريط مزدوج يتكون من العديد من القواعد، ويتواجد بشكل أساسي في نواة الخلية. أربع قواعد أساسية هي التي تكون الــ DNA وهي الثايمين والأدنين والجوانين والسيتوزين. وأول الخطوات الأساسية التي تتيح للباحث فرصة تطبيق الأبحاث الحديثة على نحل العسل هي عزل الــDNA  للتعرف على ما به من جينات وإمكانية عزل جين معين أو رصد الاختلافات بين سلالات النحل على أساس وراثي.

بعض المفاهيم الأساسية عن الوراثة؟

    الجين: هو عبارة عن تتابع من النيكلوتيدات ويحتوى الشريط المفرد الواحد من الـ DNA على العديد من الجيناتز وهذه الجينات هي المسئولة عن كيفيه عمل ونمو كل جزء من أجزاء الجسم ويحتوى جسم الإنسان على 250 ألـف جين، أما النحل فيحتوي على 15 ألـف جين.

 

    الكروموسومات: في الحقيقة الـ DNA المتواجد في نواة خلية الإنسان -على سبيل المثال- إذا قمنا بفرده فإن طوله سوف يبلغ حوالي 3 متر. و لكن هذا الـ DNA معبأ في نواة الخلية في صورة كرموسومات. وبالتالي الكروموسومات هي أجزاء من الـDNA و يحتوى جسم الإنسان على 46 كرموسوم والنحل 32 كرموسوم.

 

     الزيجوت: هو عبارة عن اتحاد نواة البويضة الناتجة من الأنثى مع نواة الحيوان المنوي الناتج من الذكر. وفي نحل العسل يكون الزيجوت في الشغالات عبارة عن 32 كرموسوم أما في الذكر فـ 16 كرموسوم فقط . حيث إن الشغالات ناتجة من بيضة مخصبة، أما الذكر فمن بيضة غير مخصبة. ولذلك تكون صفات الذكر أكثر انعكاساً لصفات الملكة.

 

خطوات استخلاص الـ DNA

 

 في هذه التجربة سوف نستعرض الخطوات العامة الأساسية لعزل الـ :DNA

 

شكل للأدوات المطلوبة لعزل الـ DNA

الأدوات المطلوبة من اليسار إلى اليمين: (جهاز طرد مركزي دقيق- حامل دقيق – أنابيب عينات- محلول فصل – محلول ملحي مركز – بفر إعادة تعلق).

 

 

المواد المطلوبة لعزل الـ DNA

 

الخطوات الأساسية لعزل الـ DNA :

أ‌-      جمع خلايا الفحص (أرجل شغالة نحل العسل أو قطعه من الجناح أو قرن الاستشعار).

ب‌- تكسير الخلايا لإطلاق الـ DNA  منها.

ت‌- عزل الـ DNA عن البروتينات و باقي الشوائب.

ث‌- عزل الـ DNA المركز.

 

 خـطـوات العـمـل

 

1- ضع قليلا من محلول العزل أو الفصل بواسطة الحامل الدقيق إلى الأنبوبة المحتوية على العينة.

 

2- انقل الأنبوبة إلى جهاز هز.

3- و دور محلول الفصل هو إطلاق الـ DNA من الخلايا.

ويتكون محلول الفصل من مكونين رئيسيين وهما مادة منظفة أو مطهرة Detergent  وإنزيم يسمى Proteinase K حيث تقوم المادة المنظفة بقطع غشاء الخلية والجزء النووي الداخلي مما يؤدى إلى تهدم الخلايا وإطلاق الـ . DNA ولكن لا يزال الـDNA ملتف بشدة حول بروتين يسمى ألـهيستون Histones و لذلك يقوم إنزيم Proteinase K  بقطع جزء من الهيستون لتحرير الـ DNA .

 

4- توضع الأنابيب المحتوية على الخلايا ومحلول العزل في حمام مائي لمدة كافية ليحدث تحرير للـ DNA من الخلايا. والآن أضف بعضاً من المحلول الملحي المركز إلى الأنبوبة.

 

5- ضع الأنبوبة في جهاز الطرد المركزي.

 

 

6- بداخل جهاز الطرد المركزي يحدث دوران شديد السرعة للأنابيب، ويلاحظ ان الأجزاء الثقيلة من البروتين وبقايا أجزاء الخلية يحدث لها ترسيب إلى قاع الأنبوبة وتبقى شرائط الـ DNA.

 

7- يتم رج الأنبوبة لأوقات عديدة ويتم خلط الـ Isopropyl alcohol بداخل محلول الـ DNA وذلك لأن الـ DNA  غير ذائب في هذا المحلول فيمكنك الآن رؤية الـ DNA بالعين المجردة.

8- ضع الأنبوبة بداخل جهاز الطرد المركزي وأغلق غطاء الجهاز وأدر الجهاز. خلال ذلك الوقت تدار العينة داخل الجهاز. ويلاحظ أن الـ DNA يترسب إلى قاع الأنبوبة.

 

11- بمجرد التخلص من الجزء السائل والسماح للـ DNA  أن يجف فيمكنك إعادة إذابتة في المحلل الذي تريده. كما ويمكنك تخزينه في الفريزر لسنوات عديدة وكذلك كخطوة لتجارب تالية باستخدام جهاز الـ PCR.

شكل عام للأدوات المطلوبة لإتمام عزل الـ DNA  بالإضافة لـ زجاجة الـ buccal-swab

والآن وبعد التعرف على الخطوات العامة، سوف نلقي نظرة متعمقة في نحل العسل:

    حيث سوف نقوم بجمع رأس الشغالات لاستخراج الـ DNA من خلاياها، وذلك باستخدام محلول ملحي مركز وفقا لطريقة (بروفورد وآخرون سنة 1998 وطريقة ملير وآخرون سنة 1988). حيث يتم إضافة رأس الشغالات إلى 250 مل من محلولproteinasing  (وهو عبارة عن 0.2 ملجم/مل من Proteinase K ، 50 mM Tris ، 120 mM NaCl ، 1% SDS، 20 mM EDTA ، pH 8 ) ويتم خلطهم معاً. والأجزاء المتبقية بعد ذلك من كيوتيكل الرأس يتم التخلص منها ويتم هضم المحلول على درجة حرارة 55 درجة مئوي لمدة3 ساعات. ويتم اخذ حجم مناسب من أسيتات الأمونيوم 4 عياري وتضاف إلى المحلول على أن تكون بنفس حجم المحلول، ويتم خلطها بواسطة الهزاز وتترك على حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. يتم بعد ذلك عمل طرد مركزي للعينات على 8000 لفة لمدة 10 دقائق، بعد ذلك ينقل الراشح إلى أنبوبة أبندورف ويتم إضافة حجمين من الإيثانول 100%, و يتم إجراء طرد مركزي مرة أخرى على 8000 لفة لمدة 10 دقائق. يتم بعد ذلك تجفيف الجزء الراسب بواسطة الهواء لمدة 30 دقيقة بعد إضافة 1 مل من الايثانول 70%. بعد ذلك يعاد إذابة الـ DNA على مدار ليلة في 250 من 1 من 10mM Tris ، 0.1 mM EDTA .

 

     وهناك طريقة أخرى للاستخلاص من الأنسجة مثل (الرسغ، قرن الاستشعار، الجناح أو أجزاء من الجناح) ويتم هنا استخدام طريقة والش وآخرون سنة 1991م باستخدام مادة استخلاص تسمى chelex®100 . وهنا الأجزاء المراد استخلاص الـ DNAمنها يتم وضعها في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق و يتم طحنها جيدا فى هون. كميات مختلفة من محلول الـ chelex®1005% يتم إضافتها على حسب طبيعة النسيج: 200 يتم إضافتهم لقرن الاستشعار و الرسغ و 100 يتم إضافتها للأجنحة و 50 في حالة قطع أو أجزاء من الجناح. يتم بعد ذلك إجراء تحضين للعينات على 56 درجة مئوي لمدة 2 ساعة مع constant agitation و تهز لمدة 10 ثواني وتغلي بعد ذلك على 100 درجة مئوي لمدة 15 دقيقة وتهز مرة أخرى لمدة 10 ثواني يلي ذلك 3 دقائق من الطرد المركزي على 8000 لفة. 

الجزء الثاني

(الـ PCR)

مـا هو الــ PCR ؟

     هو اختصار ل Polymerase Chain Reaction أو سلسلة تفاعل البوليميرات. و الغرض الاساسى منة هو عمل نسخ عديدة من قطع معينة من الـ DNA و هو يمكنه ان يولد 100 بليون نسخة متطابقة من جزء محدد من الـ DNA في خلال ساعات كما أوضح مخترع الـ PCR  و هو كارل موليس و الأمر لا يتطلب سوى أنبوبة اختبار ، كاشفات و مصدر للحرارة. و لكي نبداء في العمل بال PCR  يتطلب الأمر إلى استخلاص الـ DNA  أولا و يتم ذلك باستخدام اى جزء من الكائن الحي مثل الأجنحة أو الأرجل أو غيرها.

و خطوات العمل كالاتى:

 

 

1- ننقل الـ DNA الذي سبق استخلاصه إلى أنبوبة الـ PCR و الـ PCR  يعمل بالحرارة و تبريد المحلول مرة تلو الأخرى و لذلك تم تصميم انانيب الـ PCR لتعمل توزيع متساوي للحرارة.

 

2- يتم وضع البادئ الأول في أنبوبة الـ PCR(PRIMER 1). البادئات تتصل بموقع معين في شريط الـ DNA في كل النهايات التي نريد ان يحدث لها نسخ. و لذلك تحديد البادئات أمر مهم. و البادئات من اقوي الطرق التي تودي إلى نسخ قطع معلومة من الـDNA دون حدوث خطأ في الموقع الهدف.

 

3- نضيف البادئ الثاني و الذي سوف يرتبط بالموقع الثاني.

 

4- نضيف النيكليوتيدات (القطع الإنشائية) إلى أنبوبة الـ PCR و تلك القطع الإنشائية عبارة عن العديد من  A`S, C`S, G`S,T`S و هي التي تصنع الـ DNA. و هذه القطع الإنشائية هي التي سوف تستخدم لتخليق بلايين من نسخ الـ DNA .

            

 

5-  و أخيرا سوف نضيف الـ DNA Polymerase إلى أنبوبة الـ PCR . و هذه المادة تعمل مثل الماكينة الصغيرة التي تقرءا شفرة الـ DNA أو تربط النيوكليتيدات المتوافقة معا لتخليق نسخ من الـ DNA (اى تقوم بالعمل من عند موقع البادئ ثم تستخدم النيكلوتيدات في عمل تخليق لأجزاء محددة من الـ DNA). و هذه الجزيئات المتخصصة عديدة البوليميرات تم انتخابها بشكل خاص لتقاوم الحرارة العالية خلال تفاعل الـ PCR . و كذلك هذه المادة هي أساس تفاعل الـ PCR .

 

 

6- الآن أصبحت أنبوبة الـ PCR  بها كل مواد التفاعل و سوف يتم وضعها في جهاز الـ DNA Thermal cyclerأو جهاز الـDNA الحراري ذو الدوراتو هذه الاله يمكنها و بشكل دقيق تسخين و تبريد الأنبوبة في أوقات محددة خلال التشغيل و هذه التغيرات في درجة الحرارة حساسة لكي يعمل التفاعل (و التفاعل الذي يحدث بداخل الجهاز يمر بخطوات محددة حيث حينما ترتفع درجة الحرارة بداخل الجهاز ينفصل شريط الـ DNA إلى جزأين منفصلين و بخفض درجة الحرارة بيداء البادئ بالارتباط بالموقع المحدد ثم يقوم DNA polymerase باستخدام النيكليوتيدات منذ مكان البادئ إلى نهاية الشريط و ينسخ الـ DNA و بذلك أصبح لدينا 2 شريط من الـ DNA ثم بارتفاع درجة الحرارة مرة أخرى يحدث انفصال لل 2 شريط وبانخفاض درجة الحرارة مرة أخرى يرتبط البادئ مرة أخرى بالمكان المحدد ثم يقوم الـ DNA polymerase باستخدام النيكليوتيدات لنسخ الـ DNA و بالتالي أصبح لدينا 4 شرائط من الـ DNA ثم تعاد الدورة مرة تلو الأخرى إلى ان يصل عدد النسخ إلى بلايين خلال زمن قصير).

 

شكل موضح لجهاز الـ PCR

 

     و بعد الانتهاء من ذلك فأننا قد قمنا بعمل تضاعف لأجزاء محددة من الـ DNA و التي تمكننا من الدخول بعد ذلك في الطرق التي تعتمد على الـ PCR  مثل الـ RAPD و اختبار الـ RFLP و غيرها و في نحل العسل هناك العديد من البادئات التي يتم استخدامها و يتوقف ذلك على الجزء المراد عمل تضاعف له فهل هو بغرض عمل تضاعف لأجزاء من الـ DNA لتستخدم في المقارنة بين السلالات أو لغرض الكشف عن تأثير مرض ما أو غيرها من الأهداف.

 

----------------------------------------------

المراجع:

    1- Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. (1991) Chelex- 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material, BioTechniques 10, 506–513.

 

    2- Bruford M.W., Hanotte O., Brookfield J.F.Y, Burke T. (1998) Multilocus and single-locus DNA fingerprinting, in: Hoelzel A.R. (Ed.), Molecular Genetic Analysis of Populations: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, pp. 287–336.

 

    3- Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Acids Res. 16, 1215.

 

حسـام أبـو شـعرة